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轉Bt水稻Bt-SY63及其微生物多樣化對臭氧濃度升高響應

  • 發布日期:2015-06-04
  • 責任編輯:lgg
  • 論文字數:36258
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  • 論文編號:fb201506031243019787
  • 論文類型:碩士畢業論文
  • 論文價格:150

第一章 文獻綜述


1.1 近地層臭氧濃度升高及其對植物形態結構、生理生化的影響
大氣平流層中的微量臭氧(O3)可以有效吸收太陽輻射中對地表生物具有潛在危害的紫外B波(285~315 nm),在保護地球生命過程中扮演著重要角色。然而,高濃度的近地表O3卻是大氣光化學污染物的主要成分,伴隨著近現代工業技術的興起,化石燃料的過度燃燒、汽車尾氣、建筑印刷等行業的高速發展將越來越多的N氧化物(NOX)、揮發性有機化合物(VOC)排放到大氣環境中,這些化合物在強光照射、高溫等條件下發生反應形成O3(Ryerson et al.,2001)。近年來,近地層臭氧濃度背景值以每年0.5%到2.5%的速度遞增,本世紀初全球陸地上空近地層的臭氧平均濃度已達到60nL L-1,遠超過了敏感植物包括主要農作物臭氧損傷的40nL L-1的閥值,而東亞地區特別是我國的中東部,臭氧濃度增幅更大,預計2030年前后,臭氧濃度將增加50%左右(Vingarzan,2004;Ashmore etal.,2004;IPCC,2007;李莉,2008;Emberson et al.,2009)。高濃度臭氧對植物的形態結構、生理生化、生物量和產量等都造成不同程度的損傷,美國每年因農作物遭臭氧等光化學煙霧污染而造成的損失達上百億美元,臭氧煙霧對農作物的損害,每年使歐洲農業損失約60億歐元。我國水稻和小麥的產量損失到2020年前后預計將達到10%和40%左右(Ashmore,2005;Feng et al.,2003;Feng et al.,2009;Wang et al.,2007)。濃度逐漸增高的臭氧在成為東亞乃至世界范圍大氣最重要的污染物之一的同時,它對植物及由此產生的連鎖影響亦成當今世界科學家及公眾密切關注的重要問題。
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1.2 近地層臭氧濃度升高對植物基因表達的影響
以前臭氧脅迫的分子生理研究主要集中在通過高通量組學來比較植物細胞分子變化,當前的研究則主要集中在基因與蛋白的表達和調控方面,特別是與細胞排毒、抗氧化防御能力相關的酶和已知編碼這些酶的關鍵基因的研究。臭氧誘導了基因表達的深層變化。在臭氧脅迫下植物基因表達的調控發生改變,如在關于擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態型的臭氧熏氣實驗中發現,與自然大氣的對照只有 58 個基因上調和 577 個基因下調的轉錄本相比,在臭氧的影響下擬南芥生態型各有 400 個轉錄本上調和 800 個轉錄本下調(Miyazaki et al.,2004)。Cho等(2013)對臭氧脅迫下水稻的圓錐花序和谷粒通過高通量低聚糖 DNA 微陣列技術進行研究后發現,臭氧脅迫分別使圓錐花序的 177 個基因上調和 444 個基因下調,谷粒的 24 個基因上調和 106 個基因下調,其中,差異表達的基因主要參與水稻的信號傳遞、激素、轉錄、蛋白質水解和防御過程,還發現了許多對臭氧敏感的新基因,如編碼鈣依賴蛋白激酶、磷脂酰肌醇激酶、G-蛋白組件和細胞壁相關蛋白激酶等的基因。通過研究發現在臭氧影響下,三碳(C3)植物的各種酶,如 Rubisco (Pelloux et al.,2001;Dizengremel et al.,2009)、PEPC(Dizengremelet al.,2009)等酶的活性和數量改變,蛋白受到調控。此外,Short 等人(2012)證實了擬南芥對臭氧脅迫響應的基因表達中依賴鈣離子(Ca2+)的變化不只是活性氧誘導的(Ca2+)cyt本身增加的結果,隨著臭氧濃度和時間的變化,過氧化氫和鈣離子均顯著改變。這一發現符合在植物體內復雜鈣離子信號的時空動態下,特定刺激的轉錄信息也可以被編碼的假設。另外,Markus 等用臭氧處理樺樹后得到了一個 1.3 kb 的與植株的抗臭氧性狀相關的 cDNA 片段。
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第二章Bt-SY63及SY63水稻組織生理對臭氧濃度升高的響應


2.1 材料與方法
試驗地位于江蘇省江都市小紀鎮良種場(119°42′0″E,32°35′5″N)的中國O3-FACE(Ozone Free Air Controlled Enrichment)系統研究平臺,該地耕作方式為水稻-冬小麥復種,是典型的稻麥復種農田生態系統。該地年均降水量 980mm左右,潛在年蒸發量>1100mm,年平均溫度 14.9℃,年日照時間>2100h,年無霜期 220d。試驗用土取自育秧田表層(0~20cm)土壤。土壤類型為砂漿水稻土,理化性質:容重為 1.2g•cm-3,有機質含量 17.42g•kg-1,全氮 1.59g•kg-1,全磷 1.23g•kg-1,有效磷 10.4 mg•kg-1,全鉀 14.02 g•kg-1,pH 6.8。O3-FACE 平臺于 2007 年 3 月開始運行,試驗平臺設有 3 個 O3處理圈(ElevatedO3)和 3 個對照圈(Ambient O3)。Elevated-O3圈設計為直徑 14m 的正八面形,Elevated O3圈與 Ambient O3圈之間間隔大于 70m,以減少 O3釋放對 Ambient O3圈的影響。通過圍成正八角形的 8 根橡膠管帶上直徑 0.5 mm×0.9 mm 的小孔在作物冠層上方 50~60 cm 向圈中心噴射 O3氣體,晴天每天 09:00~18:00 釋放 O3,電腦控制使 Elevated O3圈內 O3濃度始終保持在 Ambient 的 1.5 倍,控制誤差為10%。對照田塊沒有安裝管道,環境條件與自然狀態完全一致。2010 年 ElevatedO3圈布氣時間為 7.2~10.8,2011 年布氣時間為 6.27~10.20。試驗期間O3圈和 Ambient O3圈的 O3濃度變化見圖 2-1.
………..


2.2 結果與分析
表 2-1 的廣義線性模型的重復測量方差表明,縱觀整個生長時期,兩品種間的葉片長度和葉片面積存在著顯著差異(P<0.05)而葉片寬度沒有顯著差異。綜合 Ambient 和 O3升高兩種臭氧條件 Bt-SY63 整個生長時期的平均葉片長度和平均葉片面積均比 SY63(P<0.05)小。葉片長度還存在著顯著的時間(生長時期)效應(P<0.05),即隨著葉片的衰老,葉片長度顯著減少,而葉片寬度和葉面積沒有顯著的時間效應 (p>0.05)。O3處理沒有使葉片長度、葉片寬度和葉面積發生顯著變化(p>0.05)。O3處理與品種間的交互作用、時間與 O3處理的交互作用、時間與品種的交互作用、時間與 O3處理及品種三者之間的交互作用對葉片長度、葉片寬度和葉面積均沒有顯著影響(p>0.05)。
…………


第三章 臭氧濃度升高下 Bt-SY63 水稻中 Bt 基因........42
3.1 材料與方法......42
3.2 結果與分析......45
3.2.1 臭氧濃度升高下水稻各組織中 Bt 蛋白含量變化.........45
3.2.2 水稻葉片總 RNA 的質量檢測分析 ......48
3.2.3 實時熒光定量 PCR 分析 ....51
3.3 討論......54
第四章 臭氧濃度升高對 Bt-SY63 及 SY63 水稻的土壤.......57
4.1 材料與方法 .........57
4.2 結果與分析 .........60
4.3 討論.....77
第五章 臭氧濃度升高對 Bt-SY63 及 SY63 水稻的土壤微生物.....82
5.1 材料與方法 .........82
5.1.1 試驗地及 O3-FACE 系統 ........82
5.1.2 試驗材料及育苗.........82
5.1.3 土壤樣品采集 ......82
5.2 結果與分析 .........83
5.3 討論 .....94


第七章 臭氧濃度升高對 Bt-SY63及 SY63水稻的葉面微生物群落功能多樣性的影響


葉面微生物群落作為生態系統中極重要的一環,對植物的生長、植物抗性、生態系統中能量流動和物質循環等方面起著重要作用(Steven et al.,2003)。然而,長期以來,與根際微生物研究相比,葉際微生物研究相對較少,葉際微生物群落功能方面的研究就更少。本研究在前期對臭氧濃度升高下的轉 Bt 基因水稻及常規水稻葉面微生物群落數量和結構多樣性研究的基礎上,對臭氧濃度升高下的水稻葉面微生物功能多樣性進行了研究,以期在功能效應上闡述農田生態系統中葉面微生物群落對臭氧濃度升高的響應。平均吸光值 (AWCD) 是反映微生物群落總體活性的一個重要指標,在一定程度上反映了環境中微生物種群的數量和結構特征,接種液中含有的微生物種類和數量越多,則微孔板中能被利用的碳源種類越多且利用程度越高。分析 2010年和 2011 年不同采樣時期 Elevated O3和 Ambient 下轉基因水稻 Bt-SY63 和常規水稻 SY63 葉面微生物 AWCD 的變化發現(圖 7-1 和圖 7-2),2010 年和 2011 年,無論 Ambient 下還是臭氧濃度升高下,Bt-SY63 和 SY63 葉面微生物群落 24h 內AWCD 均較低,表明 Biolog ECO 板上的碳源基質基本未被利用。

………….


結論


近地層臭氧(O3)濃度的快速上升給世界范圍內的農作物造成了嚴重損失。水稻是世界范圍消費性食物中最重要的糧食作物,也是 O3敏感型植物。“Bt 汕優 63”是我國農業部 2009 年依法批準發放生產應用安全證書的一個轉基因抗蟲水稻品種,其在未來 O3濃度升高條件下的生理生態風險值得關注,研究 O3臭氧濃度升高下轉 Bt 基因水稻的形態結構、生理生化特性響應以及由此而波及的環境微生物的變化,對于評估我國近地表 O3濃度快速增長前景下的轉基因水稻臭氧生態風險具有重要的現實意義和應用價值。本研究以江蘇省江都小紀鎮世界上首個稻麥農田輪作生態系統上的開放式O3濃度升高(O3-FACE)試驗平臺為研究基地,模擬 2030 年前后我國東部近地表 O3濃度條件,在水稻生長的抽穗期、灌漿后期和成熟期,研究了盆栽轉 Bt基因水稻 Bt 汕優 63 (Bt-SY63)及常規水稻汕優 63(SY63)葉片表面和內部超微結構,以及兩基因型水稻葉、莖和根各組織中的可溶性蛋白含量和可溶性總糖含量對臭氧濃度升高的響應。于水稻生長的分蘗期、抽穗期和灌漿后期分別采集盆栽水稻根際表層土壤(0~15 cm)和水稻葉片,連續兩年研究和比較了臭氧濃度升高下和自然條件(Ambient)下 Bt-SY63 和 SY63 水稻根際土壤中和葉表面可培養微生物數量、微生物群落多樣性(僅土壤)、土壤細菌總數量、細菌群落結構多樣性(土壤和葉面)、微生物群落代謝功能多樣性(土壤和葉面)的變化。以不同時期的水稻葉片為試驗材料,研究分析了臭氧濃度升高下的轉 Bt 基因水稻 Bt基因的 mRNA 表達水平上的變化,并探討臭氧濃度升高下其與 Bt 蛋白表達的關系。
…………
參考文獻(略)

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